La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une méthode de mesure hydrodynamique, au même titre que l'anisotropie de fluorescence résolue en temps (TFA). Alors que la TFA permet l'étude de la diffusion moléculaire de rotation, la FCS mesure la diffusion de translation de molécules fluorescentes qui diffusent librement à travers un petit volume d'observation. La diffusion de translation est alors appréhendée par l'analyse temporelle des fluctuations d'intensité de fluorescence qui correspondent aux « entrées-sorties » des espèces moléculaires diluées à travers le volume. Ce volume peut être compris entre 0.2 et 1 fl, il est généré soit par le « pinhole » d'un microscope confocal sous excitation un photon, soit par une excitation deux photons intrinsèquement confinée (c'est le cas de notre montage). Les fluctuations d'intensités ne seront visibles que pour des solutions très diluées, de l'ordre du nanomolaire, donnant un nombre très réduit de molécules se trouvant en moyenne simultanément dans le volume d'observation. Pour autant, la FCS n'est pas à proprement parler une méthode d'étude à l'échelle de la molécule unique, mais elle s'adresse à un nombre limité de molécules.

L'analyse des fluctuations d'intensité par la fonction d'autocorrélation permet de connaître le temps de résidence moyen tau(D) des molécules dans le volume d'observation. La constante de diffusion de translation est alors calculée après estimation des paramètres géométriques qui définissent le volume. Un autre paramètre est accessible par la méthode de FCS : il s'agit de la concentration qui est appréhendée par la valeur de l'amplitude initiale de la fonction d'autocorrélation.

La spectroscopie de corrélation croisée de fluorescence (FCCS) permet de contourner le problème de sensibilité au changement de taille qui peut être rencontré. La FCCS permet de mesurer la corrélation croisée des fluctuations de fluorescence de deux espèces moléculaires d'intérêt, chacune marquée par un fluorophore spectralement distinct. Un montage expérimental de FCCS est très semblable à un montage de FCS, à ceci près qu'il nécessite deux détecteurs combinés à deux sources d'excitation, même si plusieurs montages expérimentaux sont basés sur une unique source d'excitation deux photons. Cette approche permet alors de quantifier le degré de concomitance de diffusion des deux espèces à travers le volume d'observation, et donc d'estimer la quantité d'espèces en interaction, i.e. doublement fluorescentes, en se référant à l'amplitude de la fonction de corrélation croisée. Contrairement au transfert résonnant d'énergie (FRET) dont le signal dépend fortement de la distance entre les deux marqueurs (appelés respectivement donneur et accepteur) et de leur orientation respective, le signal FCCS ne tient pas compte dans l'absolue de notion de distance entre les deux marqueurs. Ceci peut être perçu comme un avantage dans certaines situations mais aussi comme un inconvénient selon le type d'application et la question biologique sous-jacente.   

Matériel*
- Laser Mai Tai Spectra Physics (690-1040 nm, fs)
- Microscope inversé TE2000 NIKON
- Deux photodiodes à avalanches (Perkin-Elmer, SPCM-AQR-14)
- Corrélateur digital ALV 6000

Nature des échantillons
Activités enzymatiques
Interactions Protéine-Protéine
Interactions Protéine-ADN

Expériences
Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence (FCS) et Spectroscopie de Corrélation Croisée de Fluorescence (FCCS)

* Ce montage expérimental dans son ensemble est dupliqué au niveau de la plateforme d'imagerie du LBPA pour les études cellulaires en FCS. Le matériel évoqué ci-dessus est alors couplé à un microscope confocal Leica mais tire partie aussi de l'excitation multiphotonique.